在elisa实验操作步骤中最易出现的十个问题及处置解决方法

 

 

elisa实验操作问题一：无颜色

 

①实验试剂孵育的时长并没有按产品说明采用。

 

核对生物素化抗体，联接的hrp实验试剂或链霉亲和素-hrp采用的时长是不是合理。

 

②不同的试剂盒或不同的批号的实验试剂混合使用。

 

从新查验实验试剂的标签贴，保障全部组成部分都应属正采用的试剂盒。不可以混合使用不同的试剂盒或不同的批号的实验试剂。

 

③漏加酶

 

查验操作步骤，特别注意不可以漏加。

 

④hrp酶影响了叠氮钠

 

采用新制备的实验试剂，禁含叠氮钠

 

⑤标准品出现问题（若在样本孔中有数据信号）

 

按中海产品说明查验标准品的制备环节，采用一瓶新标准品

 

⑥某一器皿未清洗干净,残余灭活酶物质

 

尽量避免用试剂盒器皿，另外找务必干净整洁、安全可靠的容器。

 

⑦采用含血清的缓冲液制备/复溶抗体

 

从新核对所采用的实验试剂

 

⑧漏加显色剂a或b

 

加显色剂后仔细观察孔中液位相对高度

 

⑨实验试剂制备/采用有误

 

将试验重新做，严格规范按产品说明采用，每回制备和采用前看清楚标签贴。

 

⑩缓冲液影响

 

制备新鲜的缓冲液

 

elisa实验操作问题二：显色弱

 

①超出有效期限的企业产品或许会出现比较弱的数据信号。

 

查验中海生物技术产品的有效期限

 

②添加实验试剂的大小和时长有误

 

核对所采用的每一个实验试剂的大小正确性和添加时间是合理。

 

③实验试剂、试样用前无法稳定平衡

 

用前实验试剂、试样置室内温度稳定平衡十分钟左右

 

④降低孵育时长能使试验的数据信号变弱。

 

查验孵育的时长。

 

⑤在温度发生变化的区域环境内孵育酶标板。

 

核对孵育的溫度，应避免出现溫度的发生变化。

 

⑥采用了被影响的实验试剂

 

查验实验试剂是不是被影响。

 

⑦标准品/样本制备具体方法不标准规范

 

查验标准品/样本的制备，标准品应按产品说明做好复溶和稀释。低温贮存的样本避免出现反复冻融，禁止采用溶血样本。试样用nan3防腐,抑制了酶的反应。

 

⑧显色底物制备不标准规范

 

查验底物的制备，如大小是不是正确性，混合是不是适当充足。

 

⑨检测时间不合理

 

是不是在规定标准的时长内检测。

 

⑩仪器设备设置有误，滤色片不相匹配。

 

仪器设备是不是设置正确性，滤色片的选取是不是符合等。

 

elisa实验操作问题三：过多的数据信号，所有的板子变成规则的蓝色。

 

①不充分的的洗涤/洗涤流程被疏忽-没融合的过氧化物酶仍有残余。

 

最好是采用洗板机充分的洗涤，检测孔内是不是有残余的洗剂或加样量是不是准确。

 

②底物溶液混合过早并转成蓝色

 

应操纵底物混合的时间并马上采用。

 

③过多的酶结合物

 

检测稀释度，有必要时开展效价测定。

 

④封板膜或试剂器皿被多次重复使用，导致hrp残余，使tmb底物出现非特异蓝色。

 

采用新的封板膜，每一步采用不一样的试剂器皿

 

⑤缓冲液中被污染金属或hrp

 

制备最新缓冲液

 

elisa实验操作问题四：高cv值，花板

 

①操作步骤不规范或洗涤不充分的

 

按产品说明书洗板/加样/显色，洗板极为重要。

 

②出现干板，并没有采用封板膜、封板膜多次重复使用

 

确认每两流程间，酶标板应维持湿润。采用封板膜封口，特别注意每一步采用新的封板膜。

 

③因为错误操作或板子品质差、融合不匀称导致包板不匀称。

 

稀释用的pbs中不必加其它蛋白，检测包被和封闭液体积、时间和试剂添加的方法。检测所采用的酶标板，采用elisa板，不必采用组织培养板。

 

④移液器不准确，吸头多次重复使用。

 

检测并校准移液器。每回取样一定要换吸头。总结标本的添加流程，保障每回加样的准确性，保证吸取的液体按所设定重量吸入和排出，持续加样时特别注意检测吸头，保障所加液体的重量。

 

⑤样品离心处置不全,反应孔内出现凝血或残余细胞成份

 

标本充分在离心3000转六分钟以上，禁止采用凝血和溶血的标本

 

⑥缓冲液被污染

 

制备最新的缓冲液

 

elisa实验操作问题五：标准曲线可获得，但低或平的曲线两点之间差别很大。

 

①酶结合物不够

 

检测稀释度，有必要时开展效价测定。

 

②捕获抗体并没有很好融合到板上

 

检测所采用的酶标板，采用elisa板，不必采用组织培养板，稀释用的pbs中不必加其它蛋白。

 

③检测抗体不够

 

检测稀释度，有必要时开展效价测定

 

④板子显色不够

 

延长底物孵育实验，采用中海生物品牌的底物溶液

 

⑤操作步骤不规范

 

总结elisa操作步骤，排除一切私自调整的程序流程。

 

⑥标准曲线稀释度测算不正确

 

核查测算的具体情况，制备新的标准曲线

 

elisa实验操作问题六：标准曲线非常好，只是没有任何期许的阳性数据信号出现

 

①在样本中无相对应的细胞因子

 

采用内参对照，反复实验操作，慎重考虑实验操作的相对应参数指标

 

②样本基质遮掩检测

 

将样本起码做1∶2相对应的稀释，或开展全系列稀释观测它的恢复性

 

elisa实验操作问题七：标准曲线非常好，只是样本的判读值很高。

 

①样本中含的细胞因子水平超出检测范畴

 

将样本做稀释并再度实验操作

 

elisa实验操作问题八：当选用辣根过氧化物酶(HRP)结合物时，TMB底物加终止液后显示为绿色。

 

①孔中的试剂显色不全面

 

轻轻地振荡板子

 

elisa实验操作问题九：边缘效应

 

①工作中环境温度不均衡化

 

防止将酶标板在变化温度环境中孵育

 

elisa实验操作问题十：漂移

 

①实验操作操作过程中出现间断

 

整体实验操作应持续操作使用：在实验操作进行前将全部标准品和样本做合理的打算。

 

②试剂并没有按产品说明书稳定平衡至室内温度

 

在全部试剂添加孔前，保障它们已稳定平衡至室内温度，否则中海产品说明书中有除此之外的特殊要求。

 

其他问题：

 

①是不是可更改检测试剂盒所展示的实验操作操作步骤？

 

通常情况下生产厂家为保障最大的灵敏度和特异性，对检测试剂盒都开展了优化，为保障每个检测试剂盒实验操作的规范化应按产品说明书操作使用。

 

②是不是可混用不一样检测试剂盒中的试剂？

 

不允许。其实是绝大部分试剂在每次检测试剂盒中是特异性的，若有什么问题可与生产厂家或总经销商沟通。

 

③是不是可增多或减少样本的重量。

 

商品性的检测试剂盒所需添加的样本重量是优化的，应按产品说明书操作使用，不建议变更所加样本的重量。

 

④是不是可重判定自身的标准曲线的点？

 

可以的。产品说明书上面有推荐的制备标准曲线时所需标准品的稀释度，可更改稀释倍数和增多曲线的点，只是务必在检测范畴内，大于检测试剂盒中最大标准品的点和小于灵敏度之下的点是不成功的。

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